Важность кишечной микрофлоры
Микробиота желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) является сложной экологической системой, обеспечивающей нормальную жизнедеятельность человека. Современный уровень знаний позволяет считать микробиоту виртуальным эндокринным метаболически активным органом. Совокупность разнообразия генов микробиоты человека известна как микробиом. В отличие от других эндокринных систем или органов, которые выделяют небольшое количество гуморальных факторов, микробиота кишечника имеет большой потенциал для производства сотен биологически активных продуктов [1]. Она представляет собой огромное разнообразие микробных видов, различающихся генетически и метаболически. Кишечная микробиота включает почти триллион микроорганизмов, принадлежащих к сотням различных видов. Метагеном фекальной микробиоты включает 9,9 х 106 микробных генов, что почти в 200 раз больше, чем геном человека. Общая масса (у взрослого человека) микробиоты ЖКТ достигает 2,5–3 кг. Численность популяции только E. coli насчитывает около 6 х109 клеток, а из общей суммы клеток макро- и микроорганизмов 90% принадлежит микроорганизмам [2]. Согласно традиционному взгляду, основанному на данных культуральных методов исследования, микробное сообщество кишечника человека объединяет 1012–1014 клеток, относящихся к 17 семействам, 45 родам, более чем к 1000 видов из 12 таксономическим групп. Соотношение анаэробов к аэробам – 1000:1. В целом функциональная активность этих микроорганизмов относительно неплохо изучена. Основными функциями являются антиинфекционная защита, обеспечение питанием эпителия толстой кишки (продукция бутирата), регуляция всасывания минералов и воды, синтез витаминов группы В и К, регуляция липидного и азотистого обмена, кишечной моторики, а также многочисленные иммунные функции. Однако внедрение новых методов исследования микрофлоры за последние годы позволило получить принципиально новые данные о ее численности, видовом составе и функциональном значении [1]. Важной инициативой на сегодняшний день является «Проект микробиома человека», включающий исследования для улучшения понимания характеристик микробиоты, связанной со здоровьем и заболеваниями человека [3]. В 2012 г. опубликовано полное описание состава и разнообразия микробиомов 5 локализаций человеческого организма (кишечник, кожа, носовая полость, полость рта, влагалище) в дополнение к быстро увеличивающемуся числу статей, посвященных более специфическим микробиом-ассоциированным проектам. Большинство исследований микробиома основано на определении последовательности вариабельных областей высоко консервативного гена, кодирующего 16S-субъединицу рибосомальной РНК (16S рРНК) микроорганизмов. Этот ген присутствует в бактериях, но отсутствует у млекопитающих и содержит 9 гипервариабельных областей (от V1 до V9), что позволяет идентифицировать различные бактерии [4].
Состав кишечной микробиоты
Несмотря на значительное разнообразие видов микроорганизмов в составе микробиоты, большинство представителей принадлежат только к 4 типам современной биологической систематики: Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria и Proteobacteria. Firmicutes и Bacteroidetes составляют более 90% бактериального сообщества толстой кишки, где плотность микробиоты небольшая. В то же время представители типов Actinobacteria и Proteobacteria практически всегда присутствуют в составе микробиоты, но их содержание относительно невысоко [5]. К основным представителям кишечных Bacteroidetes относятся бактерии родов Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, Odoribacter, Barnesiella и Alistipes [6]. Тип Firmicutes включает 4 класса микроорганизмов: Clostridia, Bacilli, Erysipelotrichia и Negativicutes. Небольшое количество, не превышающее 1–2%, в кишечной микробиоте взрослых людей составляют бактерии типов Actinobacteria и Proteobacteria. Важнейшим и хорошо изученным представителем типа Actinobacteria является род Bifidobacterium. Тип Proteobacteria является гетерогенной группой грамотрицательных бактерий. К ним относятся представители семейства Enterobacteriaceae – E. coli, Klebsiella и др. Микробиота кишечника играет решающую роль в удалении из организма человека патогенных и условно-патогенных бактерий и предотвращении избыточного роста потенциально опасных «малочисленных» бактерий, колонизирующих ЖКТ. Полезные функции бактерий, населяющих кишечник человека, обсуждались еще лауреатом Нобелевской премии И.И. Мечниковым, идеи которого послужили основой для работы многих поколений исследователей. Он считал, что микрофлора кишечника может определять физическое и даже психическое здоровье человека. А открытие того факта, что бактерии кишечника человека участвуют в метаболизме лекарственных средств, произошло практически 100 лет назад.
Технологии изучения микробиома
Изучение комменсальных бактерий традиционно ограничивалось культивированием микроорганизмов. В 80-е годы C.R. Woese и G.E. Fox разработали новые молекулярно-биологические методы для исследования микробиологической экологии – ПЦР и секвенирование ДНК/РНК [7, 8]. Для исследования кишечного микробиома используют секвенирование генов 16S рРНК, метагеномику, метатранскриптомику, метапротеомику, метаболомику [4]. При помощи первого метода изучают состав сообщества, он является экономически выгодным в сравнении с другими, полуколичественным, допускает разрешение родового уровня и иногда – уровня видов. Метагеномика изучает генерацию проектов геномов, их функциональные возможности, динамику роста. Данный метод является количественным, с его помощью возможно восстановление деформированного уровня, однако в настоящее время он очень дорог. Метод метатранскриптомики основывается на изучении экспрессии генов. Как правило, выявляются высоко экспрессируемые гены. Этот метод требует немедленного сохранения и обработки свежих или замороженных остатков кишечных образцов. При метапротеомике определяются доминирующие белки. Например, белок, секретируемый кишечной палочкой (ClpB), стимулирует интестинальные гормоны (глюкагон-подобный пептид 1 – мощный антигипергликемический гормон) и пептид YY (продуцируется в подвздошной кишке в ответ на кормление). Эти гормоны активируют анорексигенные области в головном мозге, вызывая чувство сытости. Метод метаболомики изучает метаболическую производительность микробиома, является полуколичественным, обнаруживает метаболиты, которые могут продуцироваться микробами, зависеть от диеты и «хозяина». Разнообразие молекулярных анализов для обнаружения и классификации микроорганизмов, оценки их кодирующих генов и генных продуктов показало, что микробы редко существуют в изоляции. Стало очевидно, что практически все среды обитания и каждый организм на земле имеют свою микробиоту [9].
Изменения микробиома, связанные с ВИЧ-1-инфекцией
В исследованиях ВИЧ-инфицированных лиц был обнаружен ряд различий в кишечном микробиоме. Анализ доступных литературных источников показывает неоднородность в отношении типа изучаемых субъектов (подвергаемых или не подвергавшихся лечению), типа используемого метода отбора проб (ректальная губка, мазок из стула, стул, биопсия участка ткани) и уровня изучаемой бактериальной классификации. Различия в микробиомах, наблюдаемые с использованием различных методов отбора проб, были изучены разными исследователями. В своей ранней работе E.G. Zoetendal и соавт. продемонстрировали, что у ВИЧ-отрицательных лиц бактерии, полученные при биопсии слизистой оболочки кишечника, значительно отличались от бактерий, обнаруженных в кале тех же людей [10]. S.M. Dillon и соавт. также наблюдали различия в изменениях таксонов, связанных с ВИЧ, в зависимости от метода отбора проб [11]. В частности, повышенная распространенность филогенетических бактерий у ВИЧ-инфицированных была отмечена только в образцах слизистой оболочки, а это позволяет предположить, что в образцах просвета могут отсутствовать потенциально патогенные изменения. Однако связанные с ВИЧ изменения относительной численности родов и семейств в типах бактериоидов были в целом одинаковыми на всех платформах отбора проб. Кроме того, обилие некоторых таксонов (например, превотелл) в образцах слизистой оболочки сильно коррелировало с маркерами воспаления кишечника. ВИЧ-1 реплицируется в лимфоидной ткани кишечника на ранних стадиях инфекции, в результате чего происходит массивное истощение в слизистой оболочке CD4 Т-клеток, в том числе клеток Th17 и Th22, которые играют решающую роль в поддержании гомеостаза кишечника. Также развивается энтеропатия, связанная с продуцированием энтероцитами цитокинов, повреждающих слизистую оболочку, в ответ на внедрение ВИЧ.
Таким образом, оба эти механизма (местный и системный воспалительный ответ) приводят к разрушению эпителиального барьера, позволяя бактериальным продуктам и самим микроорганизмам проникать через собственную пластинку в системный кровоток – происходит бактериальная транслокация, которая приводит к системной иммунной активации и провоцирует прогрессирование заболевания у пациентов, не получающих АРТ [12].
Таксоны, связанные с иммунными маркерами при ВИЧ
Исследования микробиома человека показали, что у ВИЧ-инфицированных значительно больше распространены превотеллы и значительно меньше – бактероиды на уровне рода, чем у неинфицированных контроллеров [13–15]. Это наблюдалось в образцах стула и биопсии слизистой оболочки в когортах леченных и нелеченых ВИЧ-инфицированных. Но не во всех исследованиях микробиомов у пролеченных и нелеченых ВИЧ-инфицированных этот феномен наблюдался в образцах ректальной губки [16–18]. P. Nowak и соавт. [18] не нашли переизбытка превотелл в ВИЧ-положительной когорте, однако в начале исследования они отметили, что рост этих бактерий снизился после АРТ. В крупнейшем на сегодняшний день исследовании, посвященном изучению микробиома кишечника у ВИЧ-инфицированных, M. Noguera-Julian и соавт. [19] обнаружили высокий рост превотелл и низкий уровень роста бактерий энтеротипа в образцах стула мужчин, практикующих секс с мужчинами (МСМ), независимо от статуса ВИЧ-1-инфекции, что может объяснить предполагаемую связь между этим энтеротипом и статусом ВИЧ-инфекции в предыдущих исследованиях, которые не контролировали сексуального поведения. Изучение образцов кала жителей Уганды, где передача ВИЧ происходит преимущественно при гетеросексуальных контактах, подтверждает гипотезу о том, что преобладание превотелл обусловлено сексуальным поведением, так как не было выявило зависимости между преобладанием превотелл и серологическим статусом ВИЧ-1 или уровнем иммуносупрессии [20]. Тем не менее у ВИЧ-1-серонегативных угандийцев превотелла-преобладающая микробиота стула была на исходном уровне, возможно, из-за различий в рационе питания, поэтому исследование может оказаться недостаточно мощным для выявления небольшого роста распространенности превотелл, связанной с ВИЧ. В научной литературе сообщается об обогащении протеобактерий и реципрокном уменьшении количества фирмикутов у ВИЧ-инфицированных, особенно в образцах слизистой оболочки кишечника [21]. В исследовании D.M. Dinh и соавт. [16] протеобактерии (включая энтеробактерии), были выявлены в большом количестве у ВИЧ-позитивных лиц и способствовали иммунной активации. Эта связь между ВИЧ-инфекцией и повышенной распространенностью протеобактерий, особенно в образцах слизистой оболочки, может быть более значимой, чем сдвиг превотелла/бактероиды, учитывая склонность протеобактерий к транслокации в модели нечеловеческих приматов [22]. Результаты исследования микробиома у ВИЧ-инфицированных, не получавших АРТ, свидетельствуют о том, что продолжающееся воспаление слизистой оболочки, вызванное неконтролируемой репликацией вируса, может в значительной степени влиять на изменения микробиома. И наоборот, частичная «нормализация» микробиома, наблюдаемая при подавлении вируса при АРТ, может указывать на то, что по мере восстановления иммунной системы слизистой оболочки она способна лучше управлять кишечной средой и обеспечивать более нормальный микробиом. Однако не во всех исследованиях было обнаружено смещение микробиома в лучшую сторону после АРТ [18]. Антиретровирусные препараты могут оказывать прямое влияние на комменсальные бактерии и/или фаговые вирусы, которые их заражают, что может отчасти объяснить постоянные различия в микробиомах длительно пролеченных ВИЧ-инфицированных и серонегативных контроллеров. Потерю фекального микробного разнообразия отмечали при колите, вызванном Clostridium difficile, и воспалительном заболевании кишечника [23]. Некоторые авторы обнаружили сходную потерю разнообразия, связанную с ВИЧ-статусом [24]. Однако в нескольких публикациях сообщалось об отсутствии потери разнообразия, а в одном исследовании было обнаружило увеличение разнообразия в разных группах ВИЧ-инфицированных пациентов [25].
Расширение вирома при ВИЧ-инфекции
Анелловирусы, которые являются sDNA-вирусами, часто встречаются в образцах кала и крови людей, но не являются возбудителями заболеваний. Ранние исследования вирома показали, что уровень плазменной ДНК анелловируса увеличивается при СПИДе и других иммунодефицитных состояниях, а затем снова снижается после восстановления иммунитета [26]. Совсем недавно была исследована потенциальная роль этих вирусов в патогенезе иммунной активации. Анелловирусы были связаны с прогрессированием заболевания печени при коинфекции ВИЧ и гепатита С [27]. Исследование, проведенное среди жителей Уганды, показало, что количество анелло- и аденовирусов было выше у пациентов с низким уровнем CD4+-лимфицитов [28]. В дальнейшем предстоит выяснить, какую роль играют эти вирусы в нарушении целостности эпителиального барьера кишечника.
ВИЧ-инфекция и нарушение взаимодействия хозяин–микроб
ВИЧ-инфекция связана с хроническим воспалительным состоянием, о чем свидетельствуют повышенные уровни циркулирующих растворимых TNFR1, TNFR2, IL-6 и маркеров активации Т-клеток (экспрессия CD38 и HLA-DR) [29]. Кроме того, ВИЧ-инфекция связана с повышением уровня плазменных маркеров микробной транслокации и активации моноцитов [липополисахарид-связывающего белка (ЛПС) и растворимого CD14 (sCD14)] и повреждением эпителиального барьера [30]. Иммунная активация и разрушение кишечного барьера наиболее высоки при острой инфекции и снижаются при хронической инфекции. Отмечено, что на фоне АРТ происходит более значимое снижение [31]. На клиническом уровне повышение уровня системных маркеров воспаления, микробной транслокации и повреждения эпителиального барьера были связаны с неблагоприятными клиническими исходами [32]. N.G. Sandler и соавт. [33] показали, что sCD14 был независимым предиктором смертности при ВИЧ-инфекции. A.R. Tenorio и соавт. [34] отметили, что более высокие уровни растворимых маркеров воспаления (TNFR1, IL-6) коррелировали с заболеваниями, не связанными со СПИДом: инсультом, сердечно-сосудистыми заболеваниями и раком. Т-клетки собственной пластинки кишечника могут быть более восприимчивы к ВИЧ-инфекции из-за высокого уровня активации и экспрессии рецепторов ВИЧ, таких как CCR5 [35]. Эксперименты на моделях нечеловеческих приматов выявили быстрое и массовое истощение CD4 Т-клеток собственной пластинки уже через 7 дней после заражения [36]. У людей при ранней и острой ВИЧ-инфекции истощаются более 50% этих клеток, продуцирующих IL-17 и IL-22 [37]. Механизм этого истощения заключается в гибели инфицированных клеток в результате апоптоза, а также клеток-свидетелей в результате пироптоза [38]. Плотность CD4 Т-клеток слизистой оболочки не всегда полностью восстанавливается, несмотря на эффективную АРТ и подавление вирусной репликации [39]. Плохое их восстановление приводит к важным функциональным последствиям для барьера слизистой оболочки кишечника: неспособности защитить от вторжения патогенных микроорганизмов, а также потере цитокинов, необходимых для поддержания нормальной барьерной функции [40, 41]. Обнаружено, что плохая реконструкция CD4 Т-клеток коррелирует с дисфункцией плотного соединения между эпителиальными клетками барьера слизистой оболочки [42]. Иммуногистохимический анализ биоптатов кишечника показал, что у ВИЧ-инфицированных пациентов с плохим восстановлением CD4 Т-клеток снижается пролиферация эпителиальных клеток и усиливается инфильтрация нейтрофилов [43]. Эти изменения коррелировали с повышением уровня циркулирующего sCD14, системного маркера ЛПС-индуцированной активации моноцитов, и косвенно – микробной транслокации. Th22 и Th17 вместе с подмножеством врожденных лимфоцитов (врожденными лимфоидными клетками типа 3 – ILC3) ответственны за выработку IL-22, критического цитокина для поддержания эпителиального барьера, который вызывает опосредованную стволовыми клетками пролиферацию эпителиальных клеток в кишечнике [44]. Изучению влияния ассоциированного с ВИЧ дисбактериоза на экспрессию Th22 было посвящено недавнее небольшое пилотное исследование трансплантации фекальной микробиоты (FMT) от здоровых макак ВИЧ-инфицированным макакам. Оно продемонстрировало увеличение частоты периферических клеток Th22 после трансплантации и снижение воспалительных маркеров слизистой оболочки кишечника [45]. A.K. Steele и соавт. [38] сообщили, что пироптоз является важным механизмом ВИЧ-ассоциированной гибели CD4 Т-клеток в лимфоидной ткани кишечника в дополнение к апоптозу, вызванному прямой вирусной инфекцией. Эти данные могут объяснить усиление воспалительной реакции, наблюдаемой при ВИЧ-энтеропатии, поскольку пироптоз в конечном итоге приводит к высвобождению цитоплазматического содержимого, в том числе IL-1β, что вызывает повышенную проницаемость в плотных соединениях эпителиальных клеток кишечника и может в конечном итоге способствовать дисфункции эпителиального барьера [46]. Несколько авторов исследовали связь между различными кишечными бактериальными таксонами и периферическим восстановлением CD4 Т-клеток [47]. Изобилие Bacteroides в кале и биоптатах толстой кишки было связано с более медленным восстановлением концентрации CD4 Т-клеток, тогда как обилие лактобацилл – с более высоким их содержанием. На более широких таксономических уровнях отряд Lactobacilliales и семейство Bacteroidaceae, по-видимому, защищали клетки от истощения. Исследования с использованием пробиотиков, содержащих Lactobacillus, при ВИЧ-инфекции, по-видимому, подтверждают роль Lactobacillus spp. в снижении истощения CD4 Т-клеток, хотя в доступной научной литературе, касающейся пробиотиков, результаты были неоднозначными [48, 49]. Обилие Prevotella было связано с активацией и истощением CD4 T-клеток [50]. Связь между обилием Prevotellа и активацией Т-клеток слизистой оболочки кишечника была отмечена только при микробиомном анализе образцов биоптатов толстой кишки, а не кала или аспиратов. Это позволяет предположить, что прилипающие к слизистой оболочке бактерии могут играть более важную роль в определении ее иммунного статуса, чем просветные организмы [11]. Насколько нам известно, на сегодняшний день только в 4 работах опубликованы результаты исследований образцов микробиомов из биоптатов слизистой оболочки ЖКТ ВИЧ-инфицированных [51].
Заключение
Суммируя итоги анализа научных публикаций, можно заключить, что дисфункция ЖКТ является прогностическим фактором инфекционных и неинфекционных осложнений и смертности при ВИЧ-инфекции. Сниженная функциональная активность ЖКТ сохраняется даже на фоне АРТ. Механизмы, лежащие в основе дисфункции, до конца не изучены. Микробиота кишечника играет важную роль в элиминации из организма человека патогенных и условно-патогенных бактерий и предотвращении избыточного роста потенциально опасных микроорганизмов. Актуален не только состав кишечной микрофлоры, но и продукты их жизнедеятельности. ВИЧ-инфекция резко изменяет кишечный ландшафт, что приводит к выраженным изменениям структуры и иммунологических свойств ЖКТ. ВИЧ размножается в лимфоидной ткани кишечника, что приводит к массовому истощению CD4 Т-клеток в слизистой оболочке, в том числе Th17 и Th22, которые имеют решающее значение в целостности кишечника. При ВИЧ-инфекции развивается энтеропатия, связанная с разрушением эпителиального барьера, что позволяет проникать бактериальным продуктам, а также, возможно, жизнеспособным бактериям через собственную пластинку слизистой оболочки в системный кровоток. Возникает бактериальная транслокация, которая связана с системной активацией иммунного ответа и приводит к прогрессированию ВИЧ-инфекции. Следовательно, чтобы лучше понять влияние ВИЧ на кишечный микробиом, в будущих исследованиях нужно учитывать компоненты микробиома, связь с АРТ и с коррекцией дисбактериоза для внедрения новых парадигм лечения.
До конца не известна роль вирусных патогенов в прогрессировании энтеропатии при ВИЧ. Дальнейшие исследования того, как определенные симбиотические бактерии могут помочь пациентам с ВИЧ-инфекцией избавиться от вирусных, бактериальных, протозойных и грибковых инфекций, могут быть полезны для определения тактики обследования и лечения данной группы больных.
