ISSN 2226-6976 (Print)
ISSN 2414-9640 (Online)

Genetic typing of Brucella melitensis strains on the basis of variability analysis of INDEL loci

Kovalev D.A., Kuznetsova I.V., Zhirov A.M., Serdyuk N.S., Zhilchenko E.B., Ponomarenko D.G., Vodopyanov A.S., Vodopyanov S.O., Kulichenko A.N.

1) Stavropol Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Stavropol, Russia; 2) Rostov-on-Don Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Rostov-on-Don, Russia
Objective. To perform INDEL typing of Brucella melitensis strains isolated in different geographic regions in 1948 to 2015 for 10 loci (RS05410, RS06765, RS11140, RS12095, RS12365, RS14755, RS16525, RS05465, RS14470, and RS16540).
Materials and methods. Molecular genetic typing of 11 B. melitensis strains was carried out by polymerase chain reaction with electrophoretic detection of results. Forty-eight B. melitensis strains present in the GenBank international database were genotyped in silico.
Results. Five INDEL genotypes were identified among the 59 studied strains. Based on cluster analysis, all genotypes were grouped into 5 clusters. A correlation was established between the INDEL genotype of B. melitensis strains and their belonging to one of the 5 main genetic lines of the microorganism based on whole genome SNP analysis (wgSNP).
Conclusion. The findings allow us to consider the developed INDEL typing method as a promising additional tool for defining the origin of individual B. melitensis isolates during epidemiological investigations of brucellosis outbreaks.

Keywords

brucellosis
Brucella melitensis
INDEL
genotyping

В последние годы для эпидемиологической характеристики штаммов патогенов, наряду с классическими методами, широкое применение нашли методы генетического анализа, позволяющие не только обнаружить искомый патоген, но и изучить его на молекулярно-генетическом уровне, в том числе ретроспективно.

Модернизация системы мониторинга за возбудителем бруцеллеза неотъемлемо связана с необходимостью внедрения современных (оптимизированных) алгоритмов молекулярно-эпидемиологического анализа штаммов бруцелл, циркулирующих на отдельных территориях, и последующей геномной паспортизации патологических биологических агентов. Разработка алгоритмов идентификации изолятов, ассоциированных с топографией выделения, имеет важнейшее значение для проведения эпидемиологических расследований единичных случаев и вспышек бруцеллеза, особенно на эпизоотически условно благополучных территориях.

Среди молекулярно-генетических методов, используемых для характеристики бруцелл, широкое применение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР) с электрофоретической детекцией результатов, а в последние годы – с учетом результатов в режиме реального времени [1, 2]. Основной целью данной методики является дифференциация бруцелл до вида, а в некоторых случаях – до биовара.

В качестве эффективных подходов для генетического типирования применяются методы MLST (multilocus sequence typing) и SNP (single nucleotide polymorphism ) [3], однако использование данных методик является длительным, трудоемким и дорогостоящим и требует участия высококвалифицированного персонала.

В настоящее время для генетического типирования бруцелл используют метод MLVA, представленный несколькими схемами, содержащими от 8 до 80 VNTR-локусов с размерами повторов от 5 до 339 п.н. [4]. Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков. Например, для детекции локусов с длиной мотива менее 10 п.н. необходимо использовать сложные и трудоемкие методики определения молекулярных размеров амплифицированного фрагмента с применением капиллярных анализаторов. В ряде случаев MLVA проводят с использованием зондов с флуоресцентной меткой, что усложняет и удорожает процедуру синтеза праймеров. Для учета результатов необходим высокотехнологичный дорогостоящий секвенатор и импортные расходные материалы.

Одним из простых и информативных методов типирования является выявление INDEL-маркеров, представляющих собой вставки-делеции (insertions/deletions) нескольких нуклеотидов. Изучение полиморфизма INDEL-генов широко используется при молекулярном типировании микроорганизмов [5].

Цель исследования – INDEL-типирование по 10 локусам штаммов B. melitensis, выделенных в разных географических регионах мира, в том числе на территории юга европейской части Российской Федерации.

Материалы и методы

В работе использовали 11 штаммов B. melitensis, выделенных в период с 1948 по 2015 г., из коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора (табл. 1).

82-1.jpg (213 KB)

Обеззараживание и подготовку проб проводили согласно СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности».

Для генетического типирования были выбраны 10 INDEL-локусов, для амплификации которых были сконструированы специфичные праймеры (табл. 2).

83-1.jpg (204 KB)

ДНК выделяли с помощью комплекта реагентов «ДНК-сорб-B» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Реакционную смесь объемом 20 мкл готовили из расчета 5 мкл MgCl2-буфера, 2,5 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, по 0,2 мкл каждого праймера, 0,5 мкл ДНК-полимеразы, 1,6 мкл РНК-элюента и 10 мкл ДНК-матрицы.

Микропробирки помещали в термоциклер и проводили амплификацию по схеме: денатурация 95 °C – 15 мин; 30 циклов (денатурация 95 °C – 15 с, отжиг 56 °C – 20 с, синтез 72 °C – 15 с); 72 °C – 5 мин.

Результаты амплификации учитывали методом электрофореза в 2% агарозном геле при напряженности электрического поля 10 В/см. Анализ результатов проводили по наличию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме, затем определяли размеры полученных ампликонов по всем локусам для каждого исследуемого штамма, сравнивая их с маркером молекулярного размера.

Генотипирование in silico проводили, включая геномные последовательности 48 штаммов B. melitensis, находящиеся в открытом доступе в международной базе данных GenBank (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/ genomes/genbank/bacteria/Brucella_melitensis) (табл. 3).

84-1.jpg (499 KB)

Для численной оценки дискриминирующей способности метода генетического типирования использовали индекс Хантера–Гастона (HGDI).

Статистическую обработку данных проводили в среде языка R [6] с использованием пакетов «tidyverse» [7] и «pheatmaply» [8]. Дендрограммы строили на основе метода полной связи (Complete-linkage clustering).

Результаты

Штаммы B. melitensis, используемые в исследовании, представлены описанными нами ранее 5 основными wgSNP-генотипами (I–V), которые соответствуют потенциальному географическому происхождению изолятов [9]. Штаммы, выделенные в странах Средиземноморья, были идентифицированы как генотип I, азиатские штаммы отнесены к генотипу II, генотип III представлен штаммами африканского происхождения. Генотипы IV и V отнесены к европейской и американской линиям соответственно.

Полученные в работе данные INDEL-типирования позволили установить, что исследуемые штаммы B. melitensis представлены 5 INDEL-генотипами, обозначенными буквами А, B, C, D и E (рисунок, см. на вклейке).

Сопоставление данных INDEL-типирования штаммов возбудителя бруцеллеза и wgSNP-анализа – основного метода для определения вероятного географического региона происхождения микроорганизма, дало возможность выявить очевидную взаимосвязь INDEL-генотипа штамма с его полногеномным SNP-профилем.

Генотип А (98, 91, 76, 86, 84, 61, 80, 72, 76, 78) включал штаммы, выделенные преимущественно в странах Средиземноморья (Египет, Италия). Все штаммы генотипа А соответствовали wgSNP-генотипу I, диверсификация которого могла иметь место около 6,5 тыс. лет назад в эпоху неолита.

Штаммы второго, наиболее представительного генотипа В (98, 91, 88, 86, 84, 61, 80, 72, 76, 78) имели самое широкое географическое распространение, включая большую часть территории Евразийского континента. Примечательно, что к указанному INDEL-генотипу принадлежали все исследованные штаммы B. melitensis, выделенные на территории Российской Федерации. Генотипы А и В различались размером лишь 1 из 10 INDEL-локусов – RS12095 (76 и 88 п.н. соответственно).

Согласно ранее опубликованным данным полногеномного анализа [9], штаммы генотипа В соответствовали генетической линии II, которая сформировалась около VII в. Весьма вероятно, что многочисленные представители этой генетической линии, объединяющей 9 подгенотипов, имеют общего предка средиземноморского происхождения. Можно с большой уверенностью предположить, что изоляты B. melitensis генотипа В II произошли от так называемой восточно-средиземноморской линии, штаммы которой наиболее распространены в неблагополучных по бруцеллезу странах Ближнего Востока и Центральной Азии, имеющих длительную историю активного бартера и внешней торговли жвачными животными (овцами и козами), особенно в период экономического процветания региона – функционирования экономического пояса «Шелкового пути» [10].

Генотип С (77, 67, 76, 74, 84, 61, 80, 72, 76, 78) был представлен двумя штаммами: UK22/04 (Великобритания, 2004) и UK24/06 (Нигерия, 2006). Наиболее генетически близким к нему генотипом D (77, 67, 76, 74, 84, 61, 80, 67, 76, 78) обладали штаммы, выделенные в Африке (Сомали, Кувейт). Генотипы С и D различались аллельным вариантом INDEL-локуса RS16525 (72 и 67 п.н. соответственно). По глобальной классификации на основе wgSNP, штаммы генотипов С и D были отнесены к «африканскому» генотипу III, дивергенция которого могла произойти около 3,5 тыс. лет назад.

Генотип E (98, 67, 76, 74, 71, 65, 89, 72, 67, 61) имел смешанный состав относительно географического происхождения штаммов. Этот генотип был определен для бруцелл, выделенных в Европе (Норвегия, Португалия, Мальта), Америке (Аргентина) и 1 штамма в Азии (Индия). Следует отметить, что все европейские изоляты кластера относились к сравнительно редкому wgSNP-генотипу IV, отделившемуся от предковой ветви генотипа III и занесенному на территорию Европы, вероятно, с побережья Северной Африки. Очевидная малочисленность известных штаммов этой генетической линии может быть связана с тем, что страны Северной и Западной Европы добились практически полной ликвидации бруцеллеза сельскохозяйственных животных.

Штаммы генотипа E, выделенные в Аргентине и Индии, имели «американский» wgSNP-генотип V, сформировавшийся около X в.

Обсуждение

Стабильность INDEL-генотипа штаммов B. melitensis определенного географического происхождения, выделенных в разные годы, свидетельствует о высокой степени консервативности выбранных локусов.

Значение индекса HGDI, рассчитанное на основании анализа аллельного полиморфизма 10 INDEL-локусов, составило 0,92, что демонстрирует высокую разрешающую способность разработанного метода.

Важными преимуществами представленного метода INDEL-типирования B. melitensis по сравнению с полногеномным SNP-анализом являются экономическая эффективность и простота исполнения при наличии стандартного ПЦР-оборудования. В то же время разрешающая способность wgSNP-типирования, несомненно, выше и позволяет установить, помимо принадлежности изолята к одной из 5 основных генетических линий, конкретный подгенотип микроорганизма, что имеет особое значение при анализе штаммов наиболее распространенного «евразийского» генотипа II, подгенотипы которого (IIh и IIi) характерны для территории Российской Федерации.

На разработанный метод генетического типирования получен патент Российской Федерации на изобретение «Способ генетического INDEL-типирования штаммов Brucella melitensis» (RU 2732425 C1) [11].

Заключение

Таким образом, предложенный метод INDEL-типирования позволяет с высокой разрешающей способностью дифференцировать штаммы B. melitensis в соответствии с основными генетическими линиями глобальной популяции возбудителя бруцеллеза. Установлено, что штаммы B. melitensis, циркулирующие на территории Российской Федерации, относятся к наиболее распространенному INDEL-генотипу В.

Результаты исследования выявили высокую степень сходства INDEL-генотипов штаммов B. melitensis, циркулирующих на одной территории, что дает возможность рассматривать разработанный метод INDEL-типирования в качестве дополнительного инструмента для определения происхождения отдельных изолятов B. melitensis при эпидемиологических расследованиях. Вместе с тем применение INDEL-типирования в комплексе с другими методами молекулярной эпидемиологии позволит конструировать модели пространственно-временной диссеминации возбудителя бруцеллеза на изучаемой территории.

References

1. Orzil L., Preis I.S., Almeida I.G., Souza P.G., Soares Filho P.M., Jacinto F.B. et al. Validation of the multiplex PCR for identification of Brucella spp. Ciência Rural. 2016; 46(5): 847–52. doi: https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20150065

2. Малышев Д.В., Баннов В.А., Черных О.Ю., Василевич Ф.И., Котельникова А.А., Донник И.М. и др. Правообладатель ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина». Способ выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных. Патент РФ № 2703400, 2019.

Malyshev D.V., Bannov V.A., Chernykh O.Yu., Vasilevich F.I., Kotelnikova A.A., Donnik I.M. et al. Copyright holder of the I.T. Trubilin Kuban State Agrarian University. [Method for detecting the genome of the causative agent of brucellosis infection (Brucella spp.) in farm animals]. Patent RF № 2703400, 2019.

3. Sankarasubramanian J., Vishnu U.S., Gunasekaran P., Rajendhran J. A genome-wide SNP-based phylogenetic analysis distinguishes different biovars of Brucella suis. Infect. Genet. Evol. 2016; 41: 213–7. doi: https://doi.org/10.1016/j.meegid.2016.04.012

4. Vergnaud G., Hauck Y., Christiany D., Daoud B., Pourcel C., Jacques I. et al. Genotypic Expansion Within the Population Structure of Classical Brucella Species Revealed by MLVA16 Typing of 1404 Brucella Isolates From Different Animal and Geographic Origins, 1974–2006. Front Microbiol. 2018; 9 (8): 1253–62. doi: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01545

5. Lee H., Nguyen M.P., Choi Y., Kim Y.-H. Minimum InDel pattern analysis of the Zika virus. BMC Genomics 2018; 19(1): 535. doi: https://doi.org/10.1186/s12864-018-4935-z

6. R Core Team (2020). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. https://www.R-project.org/

7. Wickham H., Averick M., Bryan J., Chang W., McGowan L., François R. et al. Welcome to the Tidyverse. J. Open. Source Softw. 2019; 4(43): 1686. doi: https://doi.org/10.21105/ joss.01686

8. R package version 1.0.12. https://CRAN.R-project.org/ package=pheatmap

9. Pisarenko S.V., Kovalev D.A, Volynkina A.S., Ponomarenko D.G., Rusanova D.V., Zharinova N.V. et al. Global evolution and phylogeography of Brucella melitensis strains. BMC Genomics 2018; 19(1): 353. doi: https://doi.org/10.1186/s12864-018-4762-2

10. Liu Z., Wang C., Wei K., Zhao Z., Wang M., Li D. et al. Investigation of Genetic Relatedness of Brucella Strains in Countries Along the Silk Road. Frontiers in veterinary science 2021; 7: 539444. https://doi.org/10.3389/fvets.2020.539444

11. Ковалев Д.А., Кузнецова И.В., Сирица Ю.В., Ульшина Д.В., Шапаков Н.А., Бобрышева О.В. и др. авторы. Правообладатель ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. Способ генетического INDEL-типирования штаммов Brucella melitensis. Патент РФ № 2732425, 2020.

Kovalev D.A., Kuznecova I.V., Sirica Yu.V., Ul’shina D.V., Shapakov N.A., Bobrysheva O.V. et al. authors. Copyright holder of the Stavropol Plague Control Research Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, [Method for genetic INDEL-typing of strains of Brucella melitensis]. Patent RF № 2732425, 2020.

About the Authors

Dmitry A. Kovalev, Cand. Med. Sci., Head, Laboratory of Biochemistry, Stavropol Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Stavropol, Russia; kovalev_da.stv@list.ru; https://orcid.org/0000-0002-9366-5647
Irina V. Kuznezova, Bacteriologist, Laboratory of Biochemistry, Stavropol Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being Stavropol, Russia; stavnipchi@mail.ru; http://orcid.org/0000-0001-9513-0761
Andrew M. Zhirov, Researcher, Laboratory of Biochemistry, Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being Stavropol, Russia; stavnipchi@mail.ru; http://orcid.org/0000-0002-7698-7361
Natalia S. Serdyuk, Cand. Biol. Sci., Biologist, Laboratory of Collection of Pathogenic Microorganisms, Stavropol Antiplague Institute Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Stavropol, Russia; stavnipchi@mail.ru
Elena B. Zhilchenko, Cand. Biol. Sci., Head, Laboratory of Collection of Pathogenic Microorganisms, Stavropol Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Stavropol, Russia; stavnipchi@mail.ru
Dmitry G. Ponomarenko, Cand. Biol. Sci., Head, Laboratory of Brucellosis, Stavropol Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Stavropol, Russia; stavnipchi@mail.ru
Alexey S. Vodop’janov, Cand. Med. Sci., Head, Group of Virology, Rostov-on-Don Research Antiplague Institute, Rostov-on-Don, Russia; alexvod@gmail.com,; https://orcid.org/0000-0002-9056-3231.
Sergey O. Vodopyanov, MD, Head, Laboratory of Microbial Biochemistry, Rostov-on-Don Antiplague Institute Rostov-on-Don, Russia; serge100v@gmail.com; https://orcid.org/0000-0003-4336-0439
Professor Aleksandr N. Kulichenko, MD, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences; Director, Stavropol Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Stavropol, Russia; stavnipchi@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-9362-3949

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.