Antimycotic activity of Bacillus subtilis 534 strain: the bases of the probiotic sporobacterin

Открытие и внедрение в медицинскую практику антибиотиков было одним из самых важных достижений медицины ХХ века, однако постепенно ответной реакцией патогенных микроорганизмов стала выработка механизмов устойчивости к применяемым препаратам. В настоящее время распространение патогенных штаммов с множественной устойчивостью к антибиотикам достигло критического уровня, в связи с чем возникла потребность в разработке новых антибиотиков, а также иных антимикробных препаратов, сочетающих эффективность и отсутствие токсичности [1–3]. К их числу относят пробиотики – лекарственные препараты на основе живых микроорганизмов, воздействующие на патогенную микрофлору человека или нормализующие баланс нормальной кишечной микрофлоры.

К микроорганизмам-пробиотикам относят как естественных обитателей кишечника (кишечная палочка, лактобациллы и бифидобактерии), так и транзиторных (самоэлиминирующихся) бактерий. В России и других странах в последние десятилетия активно изучают бацилл в качестве транзиторных пробиотиков, в частности, штаммы вида Bacillus subtilis, чему посвящен ряд обзорных статей [4–8]. Данный вид бактерий широко распространен в природе и попадает в организм человека разными путями: с воздухом, водой, пищевыми продуктами, поэтому некоторые авторы рассматривают его в качестве одного из естественных компонентов микрофлоры кишечника [8, 9].

В России более четверти века применяют препарат споробактерин, основой которого является штамм-пробиотик B. subtilis 534 [10]. Ранее нами было показано, что штамм 534 в условиях культивирования in vitro образует несколько антимикробных веществ, активных в отношении ряда коллекционных тест-штаммов и клинических изолятов бактерий Acinetobacter baumannii, Bacillus spp., Micrococcus luteus, Klebsiella рneumoniae, Staphylococcus aureus (включая MRSA), S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, а также грибков Aspergillus niger, Candida spp., Saccharomyces cerevisiae [11–13].

Целью данного исследования было с помощью клинических изолятов патогенных грибов с различной устойчивостью/чувствительностью к противо­грибковым антибиотикам (антимикотикам) определить в опытах in vitro антимикотическую активность пробиотического штамма Bacillus subtilis 534.

Материалы и методы

Объектом исследования служил штамм Bacillus subtilis 534 – основа лекарственного препарата «споробактерин жидкий».

Условия культивирования

Глубинное культивирование штамма 534 осуществляли с использованием модифицированной среды № 2 Гаузе следующего состава: глюкоза – 1%, пептон – 0,5%, триптон – 0,3%, NaCl – 0,5%, вода водопроводная (рН 7,2–7,4). В колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 150 мл среды вносили суспензию спор штамма 534 в количестве 106/мл, после чего засеянные колбы помещали на роторную качалку со скоростью вращения 220 об/мин при температуре 28 ºС. Антимикотическую активность культуральной жидкости (КЖ) определяли на 2-е, 4-е и 7-е сутки культивирования. Для поверхностного культивирования штамма 534 и клинических изолятов грибов использовали агаризованный вариант модифицированной среды № 2 Гаузе с добавлением 2% агара. Культивирование осуществляли при 37 ºС.

Определение антимикотической активности

Антимикотическую активность КЖ штамма 534 и отдельных выделенных из нее ранее компонентов [12] определяли методом диффузии в агар. Для этого на поверхность агаровой среды с высеянным газоном исследуемого штамма клинического изолята помещали бумажные диски диаметром 6 мм с нанесенными сырцами отдельных компонентов КЖ в количестве 10 мкл или по 100 мкл КЖ штамма 534 закапывали в лунки диаметром 9 мм. Через сутки инкубирования при 37 ºС определяли диамет­ры зон задержки роста грибков вокруг дисков или лунок, являющиеся показателем антимикотической активности.

Характеристика изолятов патогенных грибков

Видовую идентификацию клинических изолятов грибков и их отношение к антимикотикам проводили на автоматическом бактериологическом анализаторе для идентификации микроорганизмов MicroScan WalkAway-96 рlus System (Siemens, Германия). Определяли чувствительность/устойчивость изолятов патогенных грибков к следующим антимикотикам медицинского назначения: амфотерицину B, миконазолу, кетоконазолу, итракона­золу и флуконазолу.

Результаты

Антимикотическую активность КЖ штамма B. subtilis 534 и выделенных из нее 3 компонентов определяли в отношении 33 штаммов патогенных грибков и 3 штаммов патогенной водоросли Prototheca spр., инфекции которой также лечат противогрибковыми антибиотиками. Из табл. 1 следует, что КЖ штамма 534 подавляет рост 26 штаммов из 36, причем рост 8 штаммов, а именно Candida catenulata 1507 и 6093, C. glabrata 13, C. krusei 247, C. parapsilosis 1380, С. tropicalis 455, Cr. neoformans 25 и Prototheca spp. 6017, подавляется не КЖ, а отдельными выделенными из нее компонентами. Это объясняется тем, что при выделении и очистке сырцов отдельных компонентов КЖ, их упаривании и последующем растворении в небольшом объеме воды концентрация активных веществ возрастает примерно в 500 раз, и с учетом описанных выше различий в методе определения антимикотической активности КЖ и ее компонентов в наносимом на диск образце содержание антимикотиков примерно в 50 раз выше, чем в образце КЖ, внесенном в лунку.

Нами установлено, что 10 из 36 клинических изолятов устойчивы ко всем 5 представителям медицинских антимикотиков 3 исследуемых групп (полиены, имидазолы и триазолы), но рост этих штаммов подавляет КЖ штамма B. subtilis 534 или ее компоненты. Только 2 штамма С. albicans (1610 и 2122) устойчивы и к КЖ, и к сконцентрированным сырцам отдельных компонентов КЖ штамма 534. Поскольку эти 2 штамма чувствительны к исследованным медицинским антимикотикам, можно предположить иную химическую природу антимикотиков штамма B. subtilis 534.

Наряду с такими свойствами, как усиление неспецифического и специфического иммунитета, стимуляция роста нормальной микрофлоры кишечника и выделение пищеварительных ферментов, действие пробиотиков может быть связано с синтезом антибиотических веществ различной химической природы. Пребывание B. subtilis в кишечнике теплокровных животных сохраняется от 10 до 30 суток, причем бактерии присутствуют в форме вегетативных клеток и спор, и до выведения из организма с калом неоднократно повторяется процесс прорастания спор и респоруляции [14, 15]. Можно предположить, что в кишечнике и в питательной среде в колбах процессы развития B. subtilis схожи, и возможно выделение антибиотических веществ in vivo, что можно рассматривать как один из механизмов действия споробактерина.

Методом дисков нами была определена чувствительность/устойчивость штамма B. subtilis 534 к применяемым в медицине антибиотикам. Штамм B. subtilis 534 устойчив к линкомицину и оксациллину, поэтому возможно назначение споробактерина одновременно с ними. Рост штамма B. subtilis 534 подавляют антибиотики: амикацин, амоксициллин/клавулановая кислота, ампициллин, ампициллин/сульбактам, азитромицин, ванкомицин, доксициклин, клиндамицин, левомицетин, фосфомицин, гентамицин, канамицин, левофлоксацин, метронидазол, налидиксовая кислота, неомицин, новобиоцин, норфлоксацин, окситетрациклин, офлоксацин, пенициллин, спектиномицин, тетрациклин, тобрамицин, триметоприм, цефазолин, цефалотин, цефотаксим, цефотаксим/клавулановая кислота, цефтриаксон, ципрофлоксацин, эритромицин, поэтому целесообразно применять их для профилактики кишечных инфекций или за несколько суток до начала курса антибиотикотерапии.

Заключение

Штамм B. subtilis 534 при росте на питательной среде in vitro образует антимикробные соединения, в том числе эффективные в отношении патогенных грибков разных видов, устойчивых к современным антимикотикам. Предположительно в кишечнике человека он также образует антимикробные соединения, активные в отношении патогенных грибков, что обусловливает его лекарственную антимикотическую эффективность. Длительное эффективное применение в медицинской практике препарата споробактерин, представляющего суспензию спор штамма B. subtilis 534, свидетельствует об отсутствии побочных эффектов.