Эпидемиологический надзор за гнойными бактериальными менингитами (ГБМ) и генерализованными формами менингококковой инфекции (ГФМИ) основан на этиологической расшифровке возбудителей и учете случаев заболевания в определенных группах населения на наблюдаемой территории в заданный период времени [1]. Этиологическую расшифровку случаев ГБМ следует рассматривать как «важное противоэпидемическое мероприятие», позволяющее оценивать и выбирать приоритетные пути борьбы с этими заболеваниями, то есть лабораторное подтверждение диагноза как эпидемиологический параметр мониторинга заболеваемости ГБМ «играет неоценимую роль в проведении эпидемиологического надзора и корректировании специфических профилактических мероприятий при возникновении эпидемиологического неблагополучия» [2]. С этой целью в лабораторной практике применяются различные микробиологические, серологические и молекулярно-биологические методы [1–7].
Поскольку еще до внедрения в эпидемиологическую практику молекулярно-биологических методов эпидемиологам было очевидно, что лишь одно наблюдение за показателями заболеваемости инфекционными болезнями «не может предоставить весь необходимый для постановки эпидемиологического диагноза и построения реального эпидемиологического прогноза объем информации», с целью сбора и анализа эпидемиологически значимой информации возникла необходимость в построении системы эпидемиологического надзора, «обеспечивающей сбор информации о молекулярно-генетических и биологических свойствах циркулирующих на исследуемой территории возбудителей» [8]. Это связано с тем, что не все представители вида N. meningitidis способны вызывать ГФМИ [9–11]. Поэтому идентификация вида возбудителя ГБМ не всегда позволяет прогнозировать течение эпидемического процесса и планировать успешное проведение иммунопрофилактических и других противоэпидемических мероприятий, то есть не позволяет в полной мере решить одну из главных задач эпидемиологии, связанную с предэпидемической или доэпидемической диагностикой, направленной на эффективное управление заболеваемостью [8, 12]. В соответствии с положениями социально-экологической концепции наблюдение и контроль за эпидемическим процессом как сложнейшим социально-биологическим явлением диктует построение системы эпидемиологического надзора как иерархической системы с учетом всех уровней и учитывающей, в том числе, молекулярно-генетический мониторинг, а именно «слежение за молекулярно-генетической характеристикой циркулирующих штаммов паразита и ее изменчивостью» [13]. Отечественные эпидемиологи неоднократно отмечали эффективность и преимущества системного подхода к анализу эпидемического процесса, позволяющего координировать направления научной деятельности специалистов разного профиля и объективно осуществлять эпидемиологический надзор в отношении различных патогенов [8, 12–15].
В связи с этим важным инструментом микробиологического мониторинга возбудителей ГФМИ выступают методы определения внутривидовых характеристик циркулирующих штаммов и, в первую очередь, их антигенных свойств, ассоциированных или определяющих вероятность возникновения ГФМИ [1, 2, 5, 9, 10]. Поэтому при проведении микробиологического мониторинга возбудителей важная роль должна отводиться методам антигенной и генетической характеристики штаммов одного вида. Исторически наиболее распространенным способом внутривидовой классификации N. meningitidis является определение серогруппы возбудителя ГФМИ, поскольку информация о серогрупповом составе популяции возбудителей определяет стратегию и эффективность проведения иммунопрофилактических мероприятий с использованием поливалентных вакцин [2, 5, 9, 16, 17]. В то же время, несмотря на небольшое количество существующих серогрупп, ассоциированных с ГФМИ, при анализе заболеваемости ГФМИ практически на всех территориях наблюдения было отмечено циклическое течение: чередование подъемов заболеваемости с годами относительного эпидемиологического благополучия [1, 2, 5, 18, 19]. Это связано с тем, что отдельные представители часто выделяемых при ГФМИ серогрупп обладают неодинаковым инфекционным потенциалом (о чем косвенно свидетельствует относительно высокий процент бессимптомного носительства потенциально патогенных бактерий), вследствие чего для них характерна различная вовлеченность в эпидемический процесс. В XX веке были зарегистрированы эпидемии ГФМИ на всех континентах, с периодическими подъемами заболеваемости каждые 8–30 лет в зависимости от региона (исключением являются страны «менингитного пояса», где интервал между подъемами заболеваемости может быть значительно короче) [1, 2, 17].
Для эпидемических вспышек ГФМИ характерны сдвиг в сторону взрослой части популяции, преимущественное выделение N. meningitidis одной (ведущей) серогруппы и появление очагов с множественными заболеваниями ГФМИ в организованных коллективах [1]. Отличия течения эпидемического процесса при доминирующем выделении представителей одной серогруппы N. meningitidis были отмечены и при наблюдении за эпидемическим процессом ГФМИ на территории СССР, когда представителей одних и тех же серогрупп N. meningitidis выделяли как в годы подъема, так и в годы спада заболеваемости, причем частота их выделения не всегда коррелировала с показателями заболеваемости [19, 20]. Такие факторы риска ГФМИ, как состояние макроорганизма (целостность естественных барьеров, особенности специфического и неспецифического иммунитета), социально-экономические и природные факторы могут быть ассоциированы с уровнем заболеваемости на отдельных территориях, но не всегда могут объяснить причины волнообразного характера течения эпидемического процесса. Волнообразный циклический характер течения эпидемического процесса и некоторые закономерности распространения ГФМИ убедительно объясняются различием циркулирующих возбудителей на территории в периоды подъема и спада заболеваемости [10, 17, 18, 21, 22]. Поэтому идентификация и «эпидемиологическая маркировка» штаммов, ассоциированных с эпидемическими подъемами заболеваемости, и штаммов, выделяемых при спорадическом характере заболеваемости, является важной характеристикой интенсивности эпидемического процесса ГФМИ на его молекулярном и клеточном (субклеточном) уровнях [9, 13–15]. С этой целью могут быть использованы различные подходы, из которых наибольшее распространение получили основанные на ПЦР молекулярно-биологические методы, обладающие необходимой дискриминирующей способностью для дифференциации штаммов одной серогруппы. Важные преимущества основанных на ПЦР и секвенировании молекулярно-биологических методик заключаются в возможности проведения характеристики нежизнеспособных возбудителей ГФМИ и устранении проблемы межлабораторной воспроизводимости результатов, вследствие чего появляется возможность анализировать данные в глобальном масштабе, что существенно расширяет возможности традиционного микробиологического мониторинга за счет снижения процента нерасшифрованных случаев и тем самым увеличивает объем эпидемиологически значимой информации [3, 7, 19, 23, 24].
Современная внутривидовая классификация бактерий вида N. meningitidis основана на определении антигенных и генетических свойств изолята. Согласно современным рекомендациям Европейского общества по изучению менингококковой инфекции (European Meningococcal Disease Society, www.emgm.eu) генетическая характеристика должна быть представлена данными мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ), а антигенная – серогруппой и определенными аллелями 3 вариабельных фрагментов белков наружной мембраны [3, 17, 24]. Проведение МЛСТ заключается в определении по аллельному профилю из 7 фрагментов генов сиквенс-типа и принадлежности (или ее отсутствия) к клональному комплексу, обозначенному согласно принятой номенклатуре [25]. Если определить принадлежность штамма к известному клональному комплексу не удается, может быть проведен дополнительный анализ генетических взаимоотношений штаммов с использованием информации об известных сиквенс-типах, который в ряде случаев позволяет сделать выводы об эпидемической опасности возбудителей [10, 24, 26]. Результаты МЛСТ бактерий рода Neisseria объединяются в общедоступную базу данных PubMLST (http://pubmlst.org/neisseria/).
Сочетание антигенной и генетической характеристик позволяет осуществлять всестороннюю характеристику штаммов, вовлеченных в эпидемический процесс. Антигенная структура возбудителей ГФМИ определяет иммунную реакцию организма инфицированного человека, и изменения антигенной структуры возбудителей связаны с необходимостью постоянной адаптации к условиям обитания под давлением популяционного иммунитета. В то же время использование для внутривидовой классификации только антигенных характеристик штаммов, с одной стороны, не может отражать других эволюционных процессов, приводящих к появлению клонов (клональных комплексов) с повышенными вирулентными свойствами, обусловленными рекомбинационными процессами в других генах, с другой стороны, не обеспечивает необходимой информации, отражающей эволюционно формирующиеся генетические связи в популяциях возбудителей, а также степень генетического родства штаммов, изолируемых на разных территориях с неодинаковым уровнем заболеваемости.
Основная цель проведения характеристики, учитывающей генетические свойства и отражающей внутривидовое разнообразие возбудителей, заключается в классификации представителей бактериальной популяции по эпидемиологической значимости в зависимости от источника выделения в определенный период времени, проведении характеристики генетических взаимоотношений штаммов и анализа эволюционных процессов в бактериальных популяциях для мониторинга распространения штаммов с определенными сиквенс-типами или клональных комплексов, формирующих различную интенсивность эпидемического процесса, с целью контроля циркуляции наиболее эпидемиологически значимых возбудителей.
В ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (далее – ЦНИИЭ) впервые в отечественной эпидемиологической практике применен метод МЛСТ в отношении основных возбудителей ГБМ (научные руководители исследований – канд. мед. наук Г.А. Шипулин, д-р биол. наук, проф. А.Е. Платонов и д-р мед. наук И.С. Королева). Результаты молекулярно-биологического мониторинга используются при проведении характеристики циркулирующих возбудителей и регулярно публикуются в базе данных PubMLST [23].
В результате выполненных в ЦНИИЭ исследований была проведена характеристика более чем 400 российских штаммов и биологических образцов, содержащих ДНК N. meningitidis. Молекулярно-биологическую характеристику N. meningitidis проводили преимущественно в отношении возбудителей ГФМИ, циркулирующих в текущий межэпидемический период с конца 1990-х годов, за исключением нескольких работ, посвященных характеристике штаммов, выделенных от здоровых носителей в очагах ГФМИ [11, 27]. Информация об антигенных и генетических свойствах охарактеризованных микроорганизмов была опубликована в международной базе данных PubMLST в совокупности с данными об источнике, территории и годе циркуляции возбудителя. Основные результаты проведенного молекулярно-биологического мониторинга были ранее опубликованы в работах коллектива сотрудников ЦНИИЭ [19, 22, 26, 28–31].
Результаты проведенных исследований позволили охарактеризовать антигенное и генетическое разнообразие представителей ведущих серогрупп N. meningitidis, вовлеченных в эпидемический процесс, и определить особенности их клональной структуры. На основании полученных данных МЛСТ был проведен анализ клональных комплексов возбудителей в Москве и на территории некоторых регионов России. Полученные данные МЛСТ позволили обнаружить значительное количество сиквенс-типов (в первую очередь для возбудителей серогрупп В и С) впервые, то есть до проведения этих исследований они не были описаны на других территориях. С помощью МЛСТ проведена классификация циркулирующих штаммов и определена их принадлежность к описанным в PubMLST клональным комплексам [25]. Несмотря на большое количество не описанных ранее сиквенс-типов, для большинства возбудителей была определена принадлежность к уже охарактеризованным для N. meningitidis в зарубежных исследованиях клональным комплексам [10, 24, 25]. Помимо известных клональных комплексов результаты анализа генетических взаимоотношений российских N. meningitidis позволяют говорить о циркуляции как минимум двух групп генетичски близких штаммов. Так же как и во многих предыдущих исследованиях, была выявлена (не всегда однозначная) связь между серогруппой штамма и его принадлежностью к тому или иному клональному комплексу.
На территории России были найдены представители нескольких клональных комплексов, из которых наибольшее эпидемиологическое значение имеют следующие: ST-1 complex/subgroup I/II, ST-18 complex, ST-41/44 complex/Lineage 3 и ST-11 complex/ET-37 complex. Практически все N. meningitidis серогруппы A принадлежали клональному комплексу ST-1 complex/subgroup I/II. N. meningitidis серогруппы В принадлежали клональным комплексам ST-18 complex и ST-41/44 complex/Lineage 3, в последний также входила большая часть представителей серогруппы C. Большинство охарактеризованных N. meningitidis серогруппы W принадлежали клональному комплексу ST-11 complex/ET-37 complex. Нетипируемые или бескапсульные N. meningitidis, выделенные от носителей [11, 27], за редким исключением, либо не принадлежали к известным клональным комплексам, либо входили в клональный комплекс ST-53 complex. Помимо представителей известных клональных комплексов были найдены группы генетически близких изолятов, обозначенные как «ccST-8499» и «ccST-10033». В названиях групп отмечены сиквенс-типы, объединяющие максимальное количество родственных сиквенс-типов на основании совпадений в аллельном профиле. В группу «ccST-8499» входят N. meningitidis серогрупп B и C, группа «ccST-10033» объединяет N. meningitidis серогрупп Y и W. На особенность российских возбудителей ГФМИ также указывает отсутствие представителей некоторых гипервирулентных клональных комплексов, характерных для европейских стран (в частности, представителей клонального комплекса ST-32 complex/ET-5 complex). Подробный анализ эпидемиологических особенностей выявленных клональных комплексов в сопоставлении с зарубежными данными приведен в обзоре, опубликованном ранее [24]. В ряде работ [10, 26, 29, 30] охарактеризовано основанное на определении аллелей вариабельных фрагментов белков наружной мембраны антигенное разнообразие возбудителей, входящих в эти клональные комплексы.
Основным направлением молекулярно-биологического мониторинга в начале 2000-х годов являлось выявление генетических особенностей N. meningitidis серогруппы А, ответственных за большинство случаев эпидемиологического неблагополучия на территории России в прошлом [1, 5, 16, 19, 20]. Подавляющее большинство охарактеризованных N. meningitidis серогруппы А имели сиквенс-типы ST-75 и ST-3349, которые, за редким исключением, не были выявлены на других территориях. Проведенные исследования продемонстрировали отсутствие циркуляции представителей гипервирулентного клонального комплекса ST-5 complex/subgroup III, что согласуется с данными о невысоком показателе заболеваемости в эти годы. Спорадический характер заболеваемости объясняется циркуляцией представителей генетических субгрупп VI и X, образующих клональный комплекс ST-1 complex/subgroup I/II [2, 19, 22], не ассоциированный с эпидемическим ростом заболеваемости.
Для российских штаммов серогрупп В и С характерен интенсивный рекомбинационный процесс, приводящий к изменению и нестабильности генетических характеристик штаммов и клонов. Большинство эволюционных изменений представителей этих серогрупп наблюдается в пределах известных клональных комплексов, главным образом ST-41/44 complex/Lineage 3 и ST-18 complex, а также внутри группы генетически близких изолятов «ccST-8499».
Также как и для N. meningitidis серогруппы А, для российских представителей серогруппы W характерна выраженная клональная структура: преимущественная циркуляция штаммов с сиквенс-типом ST-11, входящего в гипервирулентный клональный комплекс ST-11 complex/ET-37. Представители клонального комплекса ST-11 complex/ET-37 в течение нескольких пандемических волн получили глобальное распространение, начиная с 2000-х годов [18, 21]. Их циркуляция на фоне увеличения доли случаев ГФМИ, обусловленных N. meningitidis серогруппы W, вызывает эпидемиологическую настороженность в настоящее время и диктует необходимость дальнейшего наблюдения как за особенностями клинического течения ГФМИ, вызванных представителями этого клонального комплекса, так и за уровнем заболеваемости в отдельных популяциях [18, 21, 24, 32]. Исследование возбудителей с сиквенс-типом ST-11 с помощью массового параллельного секвенирования позволяет говорить о присутствии на наблюдаемой территории нескольких (как минимум двух) клонов с сиквенс-типом ST-11, не дискриминируемых с помощью МЛСТ [33].
Публикация результатов исследований в базе данных PubMLST позволяет использовать их для проспективной оценки эпидемической опасности циркулирующих возбудителей. В целом выявленные генетические и антигенные особенности возбудителей ГФМИ легли в основу углубленного молекулярно-биологического мониторинга, который позволил расширить представления о клональной структуре возбудителей и охарактеризовать эволюционные процессы среди представителей основных серогрупп N. meningitidis, вовлеченных в эпидемический процесс на территории России. В зависимости от особенностей эпидемического процесса, обусловленного представителями различных серогрупп, определены направления проведения предэпидемической диагностики с целью отслеживания появления или импорта на наблюдаемую территорию новых штаммов возбудителей, что в целом повышает эффективность эпидемиологического надзора за ГФМИ. Большая часть исследований по молекулярно-биологическому мониторингу N. meningitidis была выполнена с участием Российского референс-центра по мониторингу за бактериальными менингитами (руководитель – д-р мед. наук И.С. Королева) [19, 22, 27, 30, 31], полученные результаты использованы при разработке аналитических обзоров и нормативно-методических документов Роспотребнадзора, в числе которых Письмо № 01/9620-0-32 от 29.06.2010 «О взаимодействии территориальных органов и учреждений Роспотребнадзора с Референс-центром по мониторингу за бактериальными менингитами», Письмо № 01/10303-12-32 от 12.09.2012 «О результатах мониторинга за заболеваемостью менингококковой инфекцией и бактериальными менингитами в Российской Федерации в 2011 г.», Приказ от 25.07.2014 № 798 «О совершенствовании эпидемиологического надзора и профилактики гнойных бактериальных менингитов в Российской Федерации» и Письмо № 01/7608-2018-32 от 13.06.2018 «О результатах мониторинга за заболеваемостью менингококковой инфекцией и бактериальными менингитами в Российской Федерации».
В настоящее время продолжается проведение молекулярно-биологического мониторинга с использованием разработанных в ЦНИИЭ методик [6, 7, 26, 31] в соответствии с выявленными особенностями российских возбудителей и намеченными ранее направлениями исследований в отношении ведущих серогрупп N. meningitidis [19, 21, 24]. Основное направление молекулярно-биологического мониторинга – определение клональной принадлежности возбудителей ГФМИ и проспективный анализ генетических изменений среди представителей циркулирующих клональных комплексов [10, 26]. Запланирован анализ клональной структуры российских представителей серогруппы W в сопоставлении с зарубежными c помощью массового параллельного секвенирования, в отношении которых МЛСТ не обладает достаточной дискриминирующей способностью для использования его в эпидемиологических целях. Перспективным направлением исследований является также изучение патогенеза и анализ дополнительных факторов вирулентности N. meningitidis серогруппы W, часто выделяемых в последние годы от больных ГФМИ [21, 28, 32]. Другим важным направлением исследований является анализ генетических и антигенных свойств возбудителей, циркулирующих на территориях с повышенным уровнем заболеваемости [2, 4], а также оперативное изучение возможных импортированных случаев ГФМИ.
